Development of CRISPR/Cas9-mediated approaches for permanent exon skipping in Duchenne muscular dystrophy

Обоснование

Мышечные дистрофии — одна из самых распространенных групп наследственных заболеваний, особенно значимых в педиатрической практике в связи с ранним дебютом и тяжелым прогрессирующим течением [1]. Наиболее частой формой является миодистрофия Дюшена-Бейкера? (МДД), Х-сцепленное рецессивное заболевание, диагностируемое у 1 из 3500 мальчиков [1]. Клинические симптомы проявляются уже в возрасте 3-5 лет, а к 13 годам большинство пациентов теряют способность к самостоятельному передвижению [2]. Раннее развитие сердечных и дыхательных осложнений, являющихся основной причиной смертности, делает поиск эффективного лечения критически важным именно в детском возрасте [3, 4].

МДД вызвана мутациями в гене DMD, приводящими к отсутствию или выраженному дефициту белка дистрофина [5]. Большинство случаев обусловлено делециями или дупликациями, нарушающими рамку считывания. В связи с этим перспективной терапевтической стратегией является пропуск экзона, направленный на восстановление рамки считывания и синтез частично функционального укороченного дистрофина, что может смягчить фенотип заболевания [6, 7]. Раннее начало такого лечения в педиатрической популяции принципиально важно для замедления необратимых патологических изменений.

В отличие от стратегий на основе антисмысловых олигонуклеотидов, требующих повторного введения, система геномного редактирования CRISPR/Cas9 предлагает возможность однократного и необратимого пропуска экзона [8]. Высокая эффективность этого подхода была показана на животных моделях [9, 10], что делает его особенно перспективным для разработки терапии, направленной на изменение естественного течения МДД у детей. В данном исследовании мы сосредоточились на подборе таких геномных редакторов и мишеней для них, которые вызовут разрушение сайтов сплайсинга или выпадение фрагмента ДНК и обеспечат пропуск экзонов в гене DMD.

Александр, может быть просто сформулировать Цель?

Материалы и методы

Александр, у нас не специализированный журнал, пожалуйста расшифровывайте все аббревиатуры, названия генов выделяйте курсивом, используйте единую терминологию

Александр, дайте характеристику исследования и укажите где оно проведено и в какой период времени. В клинических статьях принято обозначать конечные точки (исходы) исследования –основные и дополнительные. Примененимо к вашему исследованию? Сформулируйте, чтобы читателю было понятно, что сделано, для достижения цели. Вероятно, вводные фразы в разделе «результаты» являются этими исходами. По принятому в редакции плану изложения материалов – в результатах публикуются непосредственно результаты. Уду вам признателен, если Вы систематизируете.

Подбор нРНК и клонирование плазмид. НРНК Расшифруйте аббревиатуру подбирали in silico с использованием ресурса benchling.com для целевых последовательностей в донорных и акцепторных сайтах сплайсинга экзонов 43-55 гена DMD. Для SpCas9 (PAM: NGG) и SaCas9 (PAM: NNGRR) было отобрано 27 нРНК (22 для SpCas9, 5 для SaCas9). Плазмиды pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458, Addgene #48138) для SpCas9 и pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA;U6::BsaI-sgRNA (Addgene #61591) для SaCas9 были верифицированы с помощью NGS и нанопорового секвенирования. НРНК клонировали в плазмиды, корректность вставок подтверждали секвенированием по Сэнгеру и рестрикционным анализом.

Клеточные культуры. Использовали линию HEK293T для первичного скрининга. Для валидации применяли иммортализованные миобласты здорового донора (AB1190) и пациент-специфичные миобласты, полученные путем трансдифференцировки фибробластов (культура P1789, делеция экзонов 48-54). Клеточные культуры вели по стандартным протоколам, вкратце HEK293T вели на ростовой среде DMEM 4.5г*глю/мл, 10%FBS, 1%GlutaMAX, 50ед/мл пенициллин/стрептомицин, а миобласты на среде МиоМед ( F-12 (ПанЭко, Россия) 15% FBS (Biosera, USA), 2 мМ GlutaMAX (Gibco, USA), 1,5 мкг/мл гидрокортизон (Sigma Aldrich, Germany), 10 нг/мл FGFβ (ПанЭко, Россия) и 50 ед/мл пенициллин/стрептомицин (ПанЭко, Россия); при температуре 37°C, 5% CO2.

Трансфекция и оценка эффективности. Для HEK293T использовали трансфекцию полиэтиленимином (ПЭИ). Для миобластов AB1190 оптимизировали трансфекцию с использованием Lipofectamine 3000. Эффективность трансфекции оценивали по GFP-сигналу. Геномную ДНК выделяли через 48-72 часа после трансфекции. Локусы-мишени амплифицировали с помощью ПЦР и анализировали эффективность редактирования (инделов) с использованием программ TIDE и DECODR. Эффективность редактирования нормализовали на долю трансфицированных клеток. Для оценки пропуска экзонов выделяли тотальную РНК, синтезировали кДНК и проводили ПЦР с последующим электрофорезом и массовым параллельным секвенированием (NGS) ампликонов.

Трансфекцию чего? проводили в 12 луночном планшете с помощью раствора реагента PEI в HCl (25KDa) с концентрацией 1 мг/мл, клетки рассеивали за сутки до трансфекции в количестве 350*10^3 клеток на 1 лунку 12 луночного планшета. За час до трансфекции полную ростовую среду меняли на свежую среду DMEM (PanEco, 4,5 г*глю /мл) без добавок. Трансфекцию выполняли, используя конечную концентрацию ДНК 3 мкг/мл. Соотношение PEI: ДНК=1:1 (3 мкг/мл: 3 мкг/мл). Полиплексы ДНК/PEI были сформированы добавлением PEI к плазмидной ДНК в комплексообразующем растворе OptiMEM + 1xGlutaMax, время инкубации 10-15 минут, далее добавляли раствор в лунки планшета к клеткам по каплям. Время экспозиции клеточной культуры с траснфецирующим агентом и плазмидами составляло 3,5 часа, далее меняли среду на полную ростовую без антибиотика и культивировали 48 часов для регистрации результата.

Это не повтор предыдущего абзаца? Трансфекцию миобластов проводили в 12 луночном планшете с помощью коммерческого набора LF3000 (Thermo Fisher Scientific, USA), клетки рассеивали за сутки до трансфекции в количестве 10^5 клеток на 1 лунку 12 луночного планшета. В день трансфекции конфлюэнтность составляла ~70-80%, за два часа до трансфекции полную ростовую среду меняли на свежую ростовую среду без антибиотика. Трансфекцию проводили с использованием 4.5 мкл LF3000, 3.5 мкл P3000 и 1,5 мкг ДНК согласно инструкции производителя, после трансфекции среду не меняли и клетки инкубировали в течение 48 часов. Эффективность трансфекции оценивали проценту GFP положительных событий на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter CytoFLEX, USA) через 48 часов.

Протокол трансдифференцировки

Лентивирус с MyoD был собран на основе плазмиды MyoD-T2A-dsRedExpress2, addgene #60629, любезно предоставленной Егоровой Т.В., н.с. лаборатории моделирования и терапии наследственных заболеваний, ИБГ РАН. Первичные фибробласты были трасндуцированы вирусом с трансгеном MyoD, на 4 сутки клетки были пересеяны на лунку 6 луночного планшета и в течение 8 дней проводили селекцию на пуромицине 1 мкг/мл (InvivoGen, USA), летальная доза была подобрана заранее с помощью набора Presto Blue (Thermo Fisher Scientific, USA). Экспрессию трансгена MyoD индуцировали добавлением в среду (МиоМед) 5мкг/мл доксициклина (STEMCELL Technologies, Canada). Ростовую среду меняли меняли каждые 2-3 дня с добавлением доксициклина. Продолжительность трансдифференцировки 14 дней.

Оценка эффективности геномного редактирования методом глубокого таргетного секвенирования

Геномную ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. Участки-мишени амплифицировали и готовили библиотеки для секвенирования с помощью наборов KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche, Швейцария????) и KAPA Hyper Prep (Roche, Швейцария????), используя адаптеры KAPA UDI Adapter Plate (Roche, Швейцария). Библиотеки секвенировали на платформе Illumina MiSeq (набор MiSeq v3 600, США). Частоту инделов определяли с помощью программного обеспечения CRISPResso2 [11].

Результаты исследования и их обсуждение

Подход к пропуску экзона с помощью разрушения сайта сплайсинга

Первым этапом нашего исследования стал комплексный in silico скрининг направляющих РНК (нРНК) для нуклеаз spCas9 и saCas9, нацеленных на донорные и акцепторные сайты сплайсинга экзонов 43-55 гена DMD. Учитывая, что spCas9 способна связываться с неканоническими PAM с различной эффективностью, мы использовали для spCas9 мотивы NGG, NNG и NGN, а для saCas9 – NNGRR. Из первоначально подобранных 105 нРНК для spCas9 и 38 для saCas9 после ручного отбора с акцентом на предсказанную максимальную эффективность разреза в консервативной области сайта сплайсинга, было оставлено 25 нРНК, нацеленных на экзоны 43, 44, 45, 46, 50, 51, 52, 53, 54. Две из них подходили одновременно для spCas9 и saCas9, поэтому в общей сложности было протестировано 27 генетических конструкций.

Отобранные нРНК трансфицировали в клетки HEK293Т. Экспериментальные работы по скринингу нРНК на экзоны 43-55 детально описаны ранее [12]. Вкратце ???? эффективность редактирования оценивали по проценту инделов, появляющихся в месте разреза ДНК при его репарации. Долю инделов, выявляемых с помощью программы TIDE (https://tide.nki.nl/), и нормализовали на эффективность трансфекции, которая варьировала от 17% до 66% для spCas9 и от 75% до 96% для saCas9. В результате были отобраны шесть высокоэффективных нРНК (sgDMD55sa2, sgDMD45-5sp2, sgDMD50-5sp7, sgDMD50-5sp13, sgDMD52-5sp11, sgDMD55sp3), нацеленных на сайты сплайсинга экзонов 43, 53, 54 и 55. Расчетная эффективность редактирования для этих нРНК составила от 11.5% до 47.9%. Большинство отобранных нРНК создавали разрыв в экзонной, а не интронной, части сайта сплайсинга. Делеции и дупликации в этой части мотивов могут не только нарушать сплайсинг, но и вызывать сдвиг рамки считывания в начале экзона и создавать двойной терапевтический эффект: ингибирование сплайсинга или восстановление рамки считывания, нарушенной делецией предыдущего экзона [13, 14].

Для проверки эффективности геномного редактирования в миобластах на уровне ДНК мы провели глубокое секвенирование ампликонов, фланкирующих области связывания нРНК. Этот анализ показал, что все отобранные нРНК эффективно индуцировали образование инделов в целевых локусах иммортализованных миобластов здорового донора (AB1190), что подтверждает успешную доставку и активность редакторов в этих клетках. Уровень редактирования варьировал в зависимости от мишени: для экзона 43 средняя эффективность составила 46.05%, для экзона 53 — 25.3%, для экзона 54 — 2.8%, а для двух нРНК, нацеленных на экзон 55, — 16.8% и 26.2% (рис. 1).

Рисунок 1. Эффективность образования инделов в миобластах AB1190 при их геномном редактировании с помощью CRISPR/Cas9. Пояснения в тексте.

Несмотря на высокий уровень редактирования на уровне геномной ДНК, последующий анализ методом глубокого секвенирования кДНК не выявил статистически значимого пропуска целевых экзонов (45, 50, 52, 53, 54 или 55).

Мы также проверили эффективность двух нРНК, направленных на пропуск экзона 55 в пациент-специфичных миобластах (P1789) с делецией экзонов 47-54, где пропуск экзона 55 теоретически должен восстановить рамку считывания. Обе нРНК вызывают разрез ДНК перед возникающим из-за сдвига рамки считывания стоп-кодона, и теоретически могут вызывать так называемый рефрейминг - восстановление рамки - за счет возникающих инделов, а не полного пропуска экзона. Анализ ДНК подтвердил образование инделов с эффективностью 5.0% и 3.1% для нРНКв составе spCas9 и saCas9 соответственно. Однако, как и в случае с клетками AB1190, анализ кДНК не выявил продукции мРНК с пропуском экзона 55 равно как и не было выявлено транскриптов с восстановленной рамкой.

Разработка стратегии лечения случаев МДД с? одновременного пропуска двух экзонов для коррекции нонсенс-мутаций
Помимо подхода с разрушением сайтов сплайсинга для коррекции делеций, мы разработали стратегию для лечения случаев МДД, вызванных нонсенс-мутациями в экзонах 11 или 12. Целью данной стратегии является индукция протяженной геномной делеции, охватывающей оба этих экзона, что приводит к синтезу внутренне усеченного, но функционального белка дистрофина, по аналогии с более мягкой формой заболевания – миодистрофией Беккера.

Для этого мы подобрали пары нРНК, нацеленные на интроны 10 и 12 (Таблица). В отличие от задачи подбора нРНК для разрушения сайтов сплайсинга, при которой таргетная область жестко ограничена размером мотива сайта сплайсинга, для вырезания двух экзонов в результате разрывов в интронах позволяет ужесточить требования к поиску оптимальной нРНК, ориентируясь в первую очередь на расчетную эффективность с учетом как её последовательности, так и последовательности PAM. Индивидуальная эффективность этих нРНК при раздельной трансфекции в HEK293T варьировала: для пары на основе spCas9 (10p68 и 12p96) средняя эффективность составила 61.05% и 53.14% соответственно, в то время как для пары saCas9 (10a52 и 12a88) – 23.5% и 8% соответственно.

Таблица 1. Характеристики нРНК для перманентного пропуска экзонов 11 и 12.

При попарной трансфекции нРНК в клетки HEK293T, анализ ДНК методом секвенирования по Сэнгеру подтвердил образование целевой делеции протяженностью ~45 т.п.о. для spCas9 и ~33 т.п.о. для saCas9, охватывающей экзоны 11 и 12. Помимо целевой делеции, также были обнаружены побочные продукты редактирования, такие как инверсия удаленного фрагмента и образование кольцевых молекул ДНК (рис. 2).

Рисунок 2. Перманентный пропуск экзонов 11 и 12 при попарной трансфекции нРНК, направленных к интронам 10 и 12. Пояснения в тексте.

Для количественной оценки образования делеции образцы были проанализированы метод MLPA, используемый для диагностики мышечной дистрофии Дюшенна-Беккера. Ввиду ограниченной чувствительности метода, удалось проанализировать только образцы, отредактированные с использованием нуклеазы spCas9, так как данные плазмиды обладали большей эффективностью по сравнению с saCas9. Эффективность пропуска экзонов 11 и 12 составила ~20-30% (рис. 3).

Рисунок 3. MLPA-анализ делеции (приводящей к перманентному пропуску экзонов 11-12) фрагмента гена DMD при ко-тренсфекции нРНК к интронам 10 и 12. Уровень представленности фрагмента экзонов 11 и 12 в опытных образцах ниже, чем в контрольном.

Эффективность перманентного пропуска подтвердили путем контрансфекции двух пар нРНК в иммортализованные миобласты человека AB1190. Эффективность оценивали методом глубокого таргетного секвенирования кДНК гена DMD. Она составила 6.0% и 12.6% для saCas9 и spCas9, соответственно (рис. 4), что открывает перспективу применения такого метода для восстановления рамки считывания у пациентов с мутациями, приводящими к образованию стоп-кодонов в экзонах 11 и 12 гена DMD.

Рисунок 4. Эффективность пропуска экзонов 11 и 12. Пояснения в тексте

4 Обсуждение

В настоящем исследовании мы протестировали две принципиально различные стратегии CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования чего? Возможно, пропущено слово для терапии мышечной дистрофии Дюшенна-Беккера? (МДД): 1) индукцию единичных двуцепочечных разрывов (DSB) для нарушение канонических сайтов сплайсинга с целью пропуска экзона и 2) индукцию двух одновременных двуцепочечных разрывов для полного вырезания пары экзонов, несущих нонсенс-мутации.

Эффективность на уровне ДНК не гарантирует функционального исхода на уровне мРНК. Успешное создание инделов в целевом локусе ДНК, даже с высокой эффективностью (до 46% в миобластах), не является достаточным условием для индукции терапевтического альтернативного сплайсинга. Несмотря на тщательный in silico скрининг и валидацию активности нРНК в клетках HEK293T, ни одна из шести отобранных высокоэффективных направляющих (к экзонам 45, 50, 52, 53, 54, 55) не привела к детектируемому пропуску соответствующего экзона на уровне мРНК в иммортализованных миобластах человека (AB1190) и даже в более релевантной пациент-специфичной модели (P1789), где пропуск экзона 55 теоретически должен был восстановить рамку считывания и стабилизировать транскрипты, которые как мы предполагали, могли подвергаться нонсенс-опосредованной деградации в клетках AB1190 . Наиболее вероятным объяснением неудачи является то, что инделы возникали в мотиве сайта сплайсинга, но не в канонических нуклеотидах, и поэтому незначительно повлияли на силу сайта сплайсинга. Этот результат согласуется с данными о том, что предсказание исхода редактирования сплайсинга остается сложной задачей и требует эмпирической проверки в физиологически релевантных клетках-мишенях [15]. В настоящее время изобилия не очень понятна фраза таргетируемых нуклеаз, включая нуклеазы без PAM [16], целесообразно подбирать нРНК таким образом, чтобы инделы затрагивали непосредственно канонические нуклеотиды сайта сплайсинга.

Стратегия протяженных делеций демонстрирует предсказуемую эффективность. В отличие от точечного подхода, стратегия полного удаления двух экзонов (11 и 12) через разрезы в интронах оказалась успешной. Нам удалось достичь значительного уровня (6-13%) пропуска экзонов на уровне мРНК в миобластах при использовании обоих вариантов Cas9. Для сравнения один из одобренных препаратов пожизненной терапии для пропуска экзона 51 - этеплирсен - увеличивает синтез дистрофина лишь до 0,22-0,32% от нормы [17, 18]. Таким образом, разработанная нами стратегия двойного разреза для удаления экзонов 11-12 открывает путь к лечению пациентов с нонсенс-мутациями в этих экзонах. Согласно нашим оценкам и данным ФГБНУ МГНЦ не очень понятна фраза , разрабатываемый подход потенциально применим для лечения не менее 8% российских пациентов с МДД, включая 4 типа делеций (выделены жирным шрифтом в таблице – не выделено, лучше укажите здесь), относящихся к числу наиболее частых и встречающихся примерно у 10% пациентов в целом [19]. Подход с удалением экзонов 11-12 может быть расширен и на другие мутации. Успех этой стратегии обусловлен ее принципиальной разницей: целью является не тонкое нарушение регуляторного элемента, а физическое удаление геномного фрагмента. Этот подход, по сути, моделирует природные делеции, приводящие к более мягкой форме Беккера Пожалуйста, используйте единую терминологию, и его эффективность напрямую коррелирует с эффективностью создания двух разрывов и последующего соединения концов [ссылка?]. Наличие побочных продуктов (инверсий, кольцевой ДНК) также характерно для редактирования с двумя разрезами и требует дальнейшего изучения на предмет потенциальной токсичности.

Настоящее исследование имеет ряд ограничений, которые важно учитывать в дальнейших работах. Оценка восстановления белка дистрофина была за пределами задач данного этапа, однако она представляет собой критически важный следующий шаг для валидации функционального восстановления. Кроме того, перед возможным клиническим применением будет необходимым проведение всестороннего анализа оффтаргетной активности. В перспективе усилия должны быть сосредоточены на оптимизации методов доставки редакторных систем в миобласты пациентов, исследовании подходов, с использование редакторов оснований, для более точного и безопасного редактирования, а также на оценке функциональных последствий через дифференцировку клеток в миотубы и анализ дистрофина. Продемонстрированная в этой работе успешная эффективность редактирования создает прочную основу для данных исследований.

Заключение? Пожалуйста, сформулируйте краткое заключение

Заполните ниже, лишний текст удалите

Вклад авторов

При определении вклада каждого автора настоящей работы используйте систему CRediT (см. ниже) Типовое описание вклада — это перечисление ФИО авторов с указанием вклада каждого из них в терминах CRediT. Вклад необходимо определить и в статьях с одним автором. Описание вклада следует завершить следующим заявлением: «Авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части».

Пример оформления:

• Иванов И.И. — определение концепции, работа с данными, пересмотр и редактирование рукописи;

• Петров П.П. — определение концепции, визуализация, написание черновика рукописи;

• Сидоров С.С. — валидация, пересмотр и редактирование рукописи.

Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Система CRediT (Contributor Roles Taxonomy)[1]

[1] Allen L, O’Connell A, Kiermer V.  How can we ensure visibility and diversity in research contributions? How the Contributor Role Taxonomy (CRediT) is helping the shift from authorship to contributorship. Learned Publishing. 2019;32:71-74. doi: 10.1002/leap.1210

Финансирование.

Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда № 23-15-00482. Публикация тоже за счет гранта укажите?

Конфликт интересов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Пункт публикуется по запросу со стороны авторов. Если пункт не будет заполнен, при печати статьи он будет удален из текста.

Выражение признательности не может быть адресовано анонимам и организациям. Участие последних в исследовании следует описать в разделе «Источники финансирования». Вклад не-авторов нужно конкретизировать.

Подтвердите, что лица, которых Вы благодарите, не возражают против их упоминания (например, указав в скобках «согласие на упоминание в настоящей работе получено») — эта информация не публикуется.

Участие профессиональных писателей (райтеров) в создании, пересмотре и редактировании рукописи следует упомянуть в обязательном порядке.

Вклад авторов

При определении вклада каждого автора настоящей работы используйте систему CRediT (см. здесь). Типовое описание вклада — это перечисление ФИО авторов с указанием вклада каждого из них в терминах CRediT. Вклад необходимо определить и в статьях с одним автором. Описание вклада следует завершить следующим заявлением: «Авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части».

Пример оформления:

• Иванов И.И. — определение концепции, работа с данными, пересмотр и редактирование рукописи;

• Петров П.П. — определение концепции, визуализация, написание черновика рукописи;

• Сидоров С.С. — валидация, пересмотр и редактирование рукописи.

Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

1. Emery AE. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases — a world survey. Neuromuscul Disord. 1991;1(1):19–29. doi: 10.1016/0960-8966(91)90039-u

2. Николенко Н.Ю., Гончарова О.В., Артемьева С.Б. и др. Реабилитация детей с прогрессирующей мышечной дистрофией Дюшенна. Российский вестник перинатологии и педиатрии 2014; 4: 28-31. (Nikolenko N.Yu., Goncharova O.V., Artemyeva S.B. et al. Rehabilitation of children with progressive muscular dystrophy Duchenne. Russian bulletin of perinatology and pediatrics 2014; 4: 28-31).

3. Жданова Е.Б., Харламов Д.А., Белоусова Е.Д. Соматические нарушения при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна. Российский вестник перинатологии и педиатрии 2011; 5: 46-50. (Zhdanova E.B., Kharmalov D.A., Belousova E.D. Somatic disorders in Duchenne muscular dystrophy. Russian bulletin of perinatology and pediatrics2011; 5: 46-50).

4. Simonds A.K., Muntoni F., Heather S. et al. Impact of nasal ventilation on survival in hypercapnic Duchenne muscular dystrophy. Thorax 1998; 53(11): 949-52.

5. Koenig M., Monaco A.P., Kunkel L.M. The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein. Cell 1988; 53(2): 219-28.

6. Kole R., Leppert B.J. Targeting mRNA splicing as a potential treatment for Duchenne muscular dystrophy. Discov. Med. 2012; 14(74): 59-69.

7. van Deutekom J.C., van Ommen G.J. Advances in Duchenne muscular dystrophy gene therapy. Nat. Rev. Genet. 2003; 4(10): 774-83.

8. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8(11): 2281-308.

9. Long C., Amoasii L., Mireault A.A. et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science 2016; 351(6271): 400-3.

10. Amoasii L., Hildyard J.C.W., Li H. et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of duchenne muscular dystrophy. Science 2018; 362(6410): 86-91.

11. Clement, K., Rees, H., Canver, M.C. et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat Biotechnol 37, 224–226 (2019). https://doi.org/10.1038/s41587-019-0032-3

12. Медицинская генетика 2024. Том 23. Номер 8 Медицинская генетика [Medical genetics] 2024; 23(8) https://doi.org/10.25557/2073-7998.2024.08.33-39 Medical genetics 2024. Vol. 23. Issue 8

13. Kondratyeva E., Bukharova T., Efremova A. et al. Health Characteristics of Patients with Cystic Fibrosis whose Genotype Includes a Variant of the Nucleotide Sequence c.3140-16T>A and Functional Analysis of this Variant. Genes (Basel). 2021;12(6): 837.

14. Min Y.L., Chemello F., Li H. et al. Correction of Three Prominent Mutations in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy by Single-Cut Genome Editing. Mol. Ther. 2020;28(9):2044–2055.

15. Wu Di, Maus Natalie, Jha Anupama, Yang Kevin, Wales-McGrath Benjamin D, Jewell San, Tangiyan Anna, Choi Peter, Gardner Jacob R, Barash Yoseph (2025) Generative modeling for RNA splicing predictions and design eLife 14:RP106043 https://doi.org/10.7554/eLife.106043.1

16. Guilhem Faure et al. ,TIGR-Tas: A family of modular RNA-guided DNA-targeting systems in prokaryotes and their viruses.Science388,eadv9789(2025).DOI:10.1126/science.adv9789

17. Stein C.A. Eteplirsen Approved for Duchenne Muscular Dystrophy: The FDA Faces a Difficult Choice. Mol. Ther. 2016; 24(11): 1884-5.

18. Dowling J.J. Eteplirsen therapy for Duchennemuscular dystrophy: skipping to the front of the line. Nat. Rev. Neurol. 2016; 12(12): 675-6.

19. Bladen C.L., Salgado D., Monges S. et al. The TREAT-NMD DMD global database: Analysis of more than 7,000 duchenne muscular dystrophy mutations. Hum. Mutat. 2015;36(4):395–402